Kroužek genetiky

Kroužek genetiky – naše šance stát se vědci

Nějakým záhadným způsobem se vám podařilo zabloudit na stránky letošního genetického kroužku gymnázia Nad Alejí, s tím jsme opravdu nepočítali... no ale když už jste tady... vítejte!

Tak nejdříve něco trochu ke kroužku samotnému: byl založen v roce 2009 jako vskutku jedinečný projekt v rámci středních škol České republiky (zase nebudeme tak namyšlení, abychom se srovnávali s vyspělostí a výbavou některých škol v zahraničí). Od doby zřízení jím prošla řada studentů, kterým daly načerpané vědomosti na vysoké škole náskok před ostatními – především těm studujícím genetiku či molekulární biologii (i v zahraničí). Kroužek se soustředí především na prohlubování znalostí toho, co probíhá v tělech organismů na té nejnižší úrovni, a je tudíž ideální pro ty, kterým zamumlaná vysvětlení o DNA a genech v hodinách biologie prostě nestačí. Ale abyste nenabyli dojmu, že je to jen další hodina teorie, přednášek a zápisků – právě naopak – všichni mají možnost si na vlastní kůži (no, vlastně přes ochranné rukavice, ale skoro) vyzkoušet techniky používané v genetických laboratořích. Kroužek se bohužel schází jen přibližně jednou do měsíce, ale na druhou stranu jsou tato setkání opravdu dlouhá a intenzivní, tak nevím, jestli bychom za ten měsíc více informací byli vůbec schopni pojmout. Kroužek je určen spíše pro starší studenty, protože přeci jen požaduje pochopení učiva, které je trochu pokročilejší, ale pro velmi nadšené zájemce by se možná po domluvě s profesorkami dala udělat výjimka.
 
No, a aby naše výjimečnost nestagnovala, ale naopak rostla, tak letos podstoupíme celoroční genetický projekt, který by mohl přispět i do celosvětového výzkumu (pokud tedy vyjde, což u výzkumů bohužel není vždy zaručeno). Ale protože bychom takovýto projekt těžko zvládali sami, budou nám s ním během školního roku pomáhat vedle našich profesorů i dva studenti Přírodovědecké fakulty UK – Alžběta a Kryštof (a na ně to také budeme házet, když se projekt nepovede). Letos budeme na kroužku zkoumat část DNA rostlin (konkrétně gen pro tvorbu GADPH, enzymu přítomného při glykolýze, pokud vám to někomu něco říká). Gen se budeme snažit  z  DNA vyjmout, naklonovat , napojit ho na další, již známé geny v plazmidu, čímž se nám možná naskytne možnost zjistit  změť písmenek  A, T, C, G (pokud to uděláme správně). Pomocí počítačů a  bioinformatických serverů zhodnotíme náš výsledek a když se všechno povede, budeme tuto informaci moci zadat do  celosvětové banky, kde sbírají sekvence těchto genů.  Když  by si někdo tento gen chtěl v databázi  vyhledat, tak bude  vědět, že ho pomohli osekvenovat i dokonalí studenti z gymnázia Nad Alejí (a to dotyčného bude nepochybně zajímat).
 
Během roku sem postupně budeme dávat jednotlivé kroky výzkumu s komentářem od studenta, který se v rámci tohoto projektu stal expertem na svůj určitý krok. Tak nám držte palce a pokud jste tak napjatí na výsledek tohoto projektu jako my, tak tady můžete celý proces sledovat.

                                                                                                  Septimáni a oktaváni


Cloning and sequecing  project
Krok 1. – Extrakce DNA

22. října jsme se sešli na kroužku, abychom začali s naším letošním projektem, výzkumem genu pro tvorbu GADPH, enzymu, který se účastní glykolýzy.

A protože se všichni tak rádi učíme, museli si dva z nás nastudovat tu část procesu, kterou jsme toho dne prováděli a prezentovat a vysvětlit ji pro ostatní. Ještě předtím bylo nutné připravit všechny věci a nástroje potřebné k tomu, abychom mohli vůbec začít. A zde nastal první zádrhel. Neměli jsme 9V baterii do vah a jiné, stejně jemně vážící ve škole nejsou. Naštěstí se nám nakonec podařilo získat ji od pana profesora Hrubeše, čímž mu děkujeme za záchranu.

Když bylo konečně vše připraveno a každý věděl, co máme dělat (snad), mohli jsme konečně začít s praktickou částí. Prvním krokem bylo čerstvou rostlinu rozmělnit na co nejmenší části (pozn. i kuchařské schopnosti jsou u genetika plusem). Potom jsme přidali lyzační pufr a mix zahřáli ve vodní lázni. Zde proběhlo rozpuštění cytoplazmatické membrány všech buněčných částí.

Abychom mohli DNA oddělit od buněčných zbytků, museli jsme to celé centrifugovat, poté odebrat horní vrstvu,(nazýváme ho supernantant) kde se, doufejme, neviditelná DNA nacházela. Následovala fáze, kterou asi žádný molekulární genetik nemá moc v lásce – pročišťování, čili odborně purifikace. To se totiž skládá z několikanásobné centrifugace, proplachování vzorku sterilní vodou a další a další centrifugace a to několikrát dokola. Vše proto, aby se DNA zbavila přebytečných látek, které by nám v dalších krocích překážely.

A potom už jsme se konečně mohli pustit do zábavnější části, pokud tedy vyjde, a tou je množení (kopírování) úseku DNA. K tomu jsme potřebovali několik důležitých složek. Hlavně primery, jakési molekulární kleště, které nám oddělí vytoužený úsek a zajistí, že právě jen tento úsek genu se namnoží. Dále nukleotidy, ze kterých se budou nové kopie genu skládat a proteiny, které namnožení umožní. Celou tuto směs jsme společně s DNA dali do PCR zařízení, ve kterém probíhá polymerázová řetězová reakce, tj množení DNA za změny teplot v různých fázích.  DNA teď odpočívá v mrazáku a čeká na další kroužek. Teď nezbývá než jen doufat, že jsme celý postup udělali správně a příště, 19. 11. budeme s naším namnoženým kouskem DNA moci dál pracovat. 

                                                                                                    Barbora Zelenková OA

Doufáme, že to vyjde 

Dne 19. 11. jsme se opět sešli na genetickém kroužku, jehož hlavním úkolem bylo tentokrát namnožit produkty PCR, které jsme získali v minulém kroužku. Ještě před tímto úkonem jsme ale museli z produktů odstranit primery, v našem případě malé úseky DNA (ty nám pomáhají navázat enzym polymerázu, která zajišťuje následnou replikaci). Přebytek  primerů by nám  mohl zkreslit další výsledky.  Abychom odstranění primerů dosáhli, museli jsme využít enzymu exonukleázy I. Ta nám sice pomohla zbavit se primerů, ale sama exonukleáza nám ale zůstala součástí produktů. Pro další reakce by byla také překážkou, tak jsme se jí postupem purifikace zbavili.

 
Poté jsme mohli konečně zahájit druhé kolo PCR, ve kterém produkty byly replikovány za přítomnosti tzv. nested primerů. Součaně jsme do PCR dali i vektorový  plasmid  se známou velikostí, který nám později poslouží jako pozitivní kontrola toho, že vše probíhá podle plánu, nedošlo ke kontaminaci a reakce skutečně proběhla. Výsledky první PCR reakce jsme ve volné chvíli ověřovali pomocí elektroforézy. Nejdříve se nám tedy vylily gely kvůli špatně zapáskovaným nosítkům, později jsme ale vše dali zase dohromady a elektroforézu dokončili. Elektroforéza se nám ale nezdařila přesně tak, jak bychom očekávali. Produkty iniciální PCR nebyly dostatečně patrné. Učitelé a instruktoři nás ale povzbudili, že výsledky 2. PCR reakce , která je mnohem citlivější,budou určitě ukazovat přítomnost genu, který hledáme. Podle toho bychom měli totiž příště vybrat vhodný vzorek rostliny, se kterým budeme dále pokračovat v našem výzkumu. 

Čekání na výsledky elektroforézy či PCR jsme si krátili našimi předem skvěle připravenými prezentacemi. Na tuto laborku jsmě měli tentokrát připraveny rovnou dvě prezentace, jednu o replikaci DNA, druhou o navrhování primerů. Obě prezentace byly úžasně odprezentovány a nám bylo hned všechno mnohem jasnější.

Nakonec jsme DNA opět uložili do mrazáku, kde na nás počká do dalšího kroužku, který se koná 10.12., a kterého se všichni už jistě nemůžeme dočkat.
    
                                                                                         Markéta Linhartová MB                        

Jsme pořád dobře

10. 12. Jsme se opět sešli na kroužku. První problém nastal s přítomností studentů. Vzhledem k tomu, že kroužek byl v době před uzavřením klasifikace, v určitou dobu byl poměrinstruktorů a studentů 1:1. Časem se někteří opozdilci dostavili, tak došlo k dočasnému výkyvu ve prospěch studentů.

Náš úkol byl jasný:  analyzovat produkty 2. tzv. nested PCR reakce. Porovnat délku získaných DNA produktů s velikostním markrem a hledat v našich produktech ten pravý, který bude obsahovat gen GAPDH. Pokud se nám v minulých laborkách podařilo tento gen vyjmout z celé DNA rostliny, pak jsme na dobré cestě. Máme totiž v úmyslu gen naklonovat, osekvenovat a posléze se pokusit přispět do světové genové banky. Mnoho pracovišť se snaží o totéž.  Princip přínosu naší práce je:  Více shodných výsledků z mnoha pracovišť téhož genu a téže rostliny dává vysokou pravděpodobnost validity sekvence daného vybraného genu a vybrané rostliny. Práce se se sekvenčními výsledky a jejich vkládání do databáze je našim vysněným cílem, který má datum  březen- duben. Tak nám držte palce.! Práce má mnoho úskalí a v každém na nás číhá mimo jiné nebezpečí, že se vzorek kontaminuje, pokazíme koncentrace. Stejně tak zachovávání určitých tepenných požadavků je pro zdárný výsledek přímo esenciální. Návazné kroky mají neúprosný časový pres. Studenti v laboratoři  kroužku tráví celé odpoledne, mnohdy až do večerních hodin. Nastává čas, kdy budou studenti pokračovat v práci i vícekrát za týden někdy i časně ráno. Všichni bojujeme tedy s časem, studenti mají někdy tendenci i „stávkovat“. Ale nakonec zvítězí zodpovědnost k výsledkům a snad i k nám dospělým, kteří se věnují nejen přípravě laboratoře, přípravě reagencií ale hlavně jim samotným.
        
10.12: V dnešním kroužku jsme překročili další úskalí. Nested PCR nám ukázala, že doposud vše běží správně. Díky další elektroforéze jsme zjistili, že ideálním vzorkem k další práci bude gen z rostliny POTOSu. Neboť všem skupinám výsledek u této rostliny vyšel stejně.  Jedna skupina někde, bohužel, v předcházejícím kroku pochybila. Bude tedy nadále pracovat se vzorkem kamarádů. Získaná genová oblast genu byla však díky předcházejícím reakcím mírně negativně obohacená o sloučeniny, které bylo nutné odstranit procesem purifikace s využitím  Kleen™ spin kolonek.  Několikanásobná chromatografie střídaná s centrifugací nám nakonec poskytla produkty bez nadbytečných nukleotidů, primerů a enzymů.tedy můžeme říci „čistý gen“
Nyní vzorky genů opět odpočívají v mrazáku a čekají na další postup. Protože v následných laborkách budeme pracovat s bakteriemi, bylo  nutné ještě před dalším kroužkem připravit misky s LB agerem , což je medium, na kterém se bakterie neúprosně množí a vytvářejí nespočetně klonů žijících v koloniích. Právě jedna z kolonií bude pro nás do budoucna hodně důležitá .Ale to předbíhám další práci, kterou za všechny 13.1. připravily :Terka Jenčová (MA), Bára Dudková a Zuzka Barešová( MB) Díky nim mohou ostatní v UT 19.1. ráno použít bakteriální kličky a naočkovat bakterie na výživné medium.

Neopomenu zde v této části poděkovat Báře Dudkové a Zuzce Barešové a Majdě Lisé za fantasticky vedenou propagační akci naší genetické laboratoře v rámci Dne otevřených dveří. I přes jejich časovou vytíženost, která je mimo vyučovacích povinnosti způsobena i frekvencí práce v genetickém kroužku si našly čas. Díky praktickými ukázkami nadchly nejen budoucí adepty studia, ale i jejich rodiče. Ohlasy byly plné pochvalných obdivů nad jejich schopnostmi a vědomostmi  Díky!!   
                                                                                                                                                                                                                                           Zpracovala Irena Skolilová
                      


Už umíme zkrotit bakterie   

19.1. v 7:00  jsme se sice rozespalí, ale přesto odhodlaní, sešli v naší školní laboratoři abychom připravili naši startovní bakteriální kulturu. K založení kultury jsme použili bakterie E-coli, které jsou k podobným pokusům vhodné hlavně proto, že nejsou nijak škodlivé a navíc, jsou to vědecky vůbec nejprozkoumanější bakterie. Na předem připravené misky s agarem (tento přírodní polysacharid, který má vysoce gelující schopnost a získáváme ho z mořských řas, nám bude sloužit jako živná půda pro naše bakterie) jsme pomocí sterilizované kličky nanesli bakterie a uložili je do trouby, abychom jim poskytli teplo a tím pádem ideální podmínky k růstu.

Hned ve středu 20.1. jsme se sešli tentokrát až po škole. Práce s bakteriemi   a obzvlášť v případě našeho výzkumu, vyžaduje  přesné postupy, proto jsme si nemohli  dovolit měsíční prodlevu. Pro další naší prácí bylo klíčové, abychom z misky s narostlými bakteriemi odebrali právě jednu koloniiz důvodu blízké genetické podobnosti - ideálně totožné.  Všechny bakterie na misce sice pochází z té samé „lahvičky“, ale jde o to, že tím jak se bakterie velmi rychle množí, může docházet k mutacím a to pak vede k tomu, že se i dvě kolonie rostoucí těsně vedle sebe, mohou podstatně lišit.
Našli jsme tedy jednu izolovanou kolonii  kterou jsme  vložili do rostoucího média, kde naše bakterie měly  ideální podmínky k růstu a množení, a zároveň do třepacího přístroje, který přes noc zajistil správnou teplotu a okysličování.

Neuběhlo ani 24 hodin a ve čtvrtek 21.1 už jsme se zase sešli na regulérním kroužku. Tentokrát nás čekaly dva podstatné kroky celé naší laboratorní: ligace a transformace. V prvním kroku šlo o vložení našeho čistého PCR produktu -rostlinného genu GAPDH (který na nás čekal v mrazáku od minulého kroužku) do klonovacího vektoru (v našem případě pJet plasmidu. Vektor je obecně v biologii molekula DNA  (v našem případě tedy kruhový plasmid,) která nám slouží jako přenašeč určité genetické informace do zvolené  buňky.  Náš pJet plasmid tedy obsahoval kromě vneseného genu ii gen pro rezistenci k antibiotiku a tzv. smrtící gen. Vnesením cizorodého genu došlo tedy k porušení  smrtícího genu ). Kdyby se nám bývalo nepodařilo vnést gen  právě do tohoto místa, došlo by k aktivaci smrtícího genu a daná bakterie by nám zahynula. Gen pro rezistenci k antibiotiku slouží jako další kontrola, že byl plazmidový vektor skutečně do bakterie začleněn. Výsledkem našeho snažení  by měla být  zdárně rostoucí bakteriální kolonie na živném mediu s antibiotikem. Pokud by se tak nestalo, bakterie by pod vlivem antibiotika nepřežila. K tomu však musel předcházet ještě druhý krok, kterým byla tzv.transformace bakterie. Tedy přenesení a přijetí našeho plasmidu bakteriemi ( konkrétně těmi, které jsme si ve středu připravili). Obohacené bakterie jsme naočkovali na misky s agarem obsahujícím již zmíněný ampicilin. Tato procedura byla poměrně náročná, vyžadovala přesnost, rychlost a hlavně neustálé udržování správné teploty (vzorky musely být udržovány většinu času na ledu). Ve večerních  hodinách jsme  odcházeli z laborky  s trochou naděje, že nám bakterie vyrostou  a že jsme zase o něco blíže vytouženému výsledku.

V pátek 22.1. proběhla jen rychlá kontrola našich bakterií. Po zjištění, že je všechno v nejlepším pořádku jsme misky utěsnili a nechali bakterie růst až do středy 3.2. Tehdy jsme si zopakovali proces z   20.1. Jednalo se o izolaci a pomnožení právě jedné separované bakteriální kolonie.  Přes noc se v třepačce prokysličila a rozmnožila. Po tomto kroku by naše bakterie měly obsahovat kromě vlastní DNA i rostlinný gen  GAPDH  a to nyní v mnoha kopiích. No a jak to s našimi bakteriemi dopadne dál? Na to už najdete odpověď v dalším našem článku!
                                                                     
                                                                                                Ema Šlechtová MA

A teď to zcentrifugujeme…

4. 2. na nás v již laboratoři čekaly zkumavky s namnoženými  bakteriemi. V každé z nich se nacházel plazmid s vloženým rostlinným genem. Úkolem dnešního kroužku bylo dostat obohacené plazmidy mimo bakteriální buňku a potom vystříhnout zkoumaný gen z plazmidu.  V jedné větě se sice tenhle úkon popsat dá, ale ve skutečnosti se jedná o mnohem složitější proceduru, při které jsme si  prověřili  kromě našich  pipetovacích  dovedností  zopakovali použití mnoha dalších laboratorních technik.
Své miniprep kultury jsme napipetovali do ependorfek. Několikanásobnou centrifugací a odstraňováním supernatantu jsme získali bakteriální pelet  na dně zkumavek.  Přidáním lyzačního pufru jsme bakterii otevřeli. Neutralizačním roztokem se nám pak ve zkumavce vysrážel jakýsi bílý „hnusík  (což byla gDNA, proteiny, celulární debris i očekávaná DNA plazmidu). Pro purifikaci plazmidové DNA (obsahuje náš gen) bylo však potřeba opět centrifugovat, tentokrát však již   supernantant. (v něm někde plaval i náš plazmid). K tomu jsme použily tzv. separační kolony.  Centrifugací jsme dosáhli toho, že se plazmid nejprve zachytil v koloně, ale po přidání promývacího pufru se plazmid nakonec pustil z kolony a byl l vymyt do nové zkumavky. Do roztoku s plazmidem jsme pak přidali předem připravený master mix. Obsahoval totiž restrikční endonukleázu, která měla vystřihnout náš gen z plazmidu. To se dělo při inkubaci ve 37 st C., A protože samotný gen je o hodně kratší než zbytek rozstřihnutého  plazmidu, tak očekáváme, že příště-17.3. si to ověříme na elektroforéze.  Do té doby í jsou  vzorky v -20 st.C   

                                                                                                Bára Dudková, MB

Elektroforéza a sekvenace

Na dnešním kroužku jsme začali nejprve se samotným potvrzením přítomnosti
našeho genu ve vzorku - gelovou elektroforézou. Následně jsme se vizualizací jejích
výsledků pod UV zářením ujistili, že transformace kýženého úseku DNA pro GAPDH do
bakterií proběhla u většiny skupin v pořádku. Poté jsme rozhodli, že vzhledem k velmi
slibným výsledkům u vzorku z rostliny Arabidopsis thaliana bude většina skupinek
pokračovat do dalšího kroku právě s těmito vzorky, až na jedinou výjimku - skupinu
pokračující i s pokojovou rostlinou Pothos.
Následovala příprava na odeslání do specializované laboratoře na sekvenátor.
Nejprve bylo potřeba označit si odesílané lahvičky odpovídajícím čárovým kódem, podle
kterého pak z výsledné sekvenace poznáme, o jaký vzorek s jakým směrem přepisu se
jednalo. Pokračovali jsme pipetováním samotného vzorku a dalších látek potřebných ke
správnému průběhu reakce. Nejdůležitější novinkou pro nás ale byly samotné sekvenační
primery, bez kterých by sekvenace vůbec neproběhla - ke každému vzorku byl
přidán jednou R (reverse) a jednou F (forward) primer, podle kterého se následně určil
směr přepisu templátu. Poté, co bylo do lahviček napipetováno vše potřebné, jsme
zbytek vzorků uložili na led (pro případ neúspěchu) a připravenou DNA jsme odeslali do
Německa na sekvenaci.
A teď už jenom doufáme, že do příštího kroužku obdržíme zpět nějaké unikátní
sekvence, díky kterým nás možná i přijmou do světové genové databáze :)

                                                                                                  Tereza Jenčová

Neviditelné tajemství

Je 17.3. Vzorky DNA, které jsme za poslední rok extrahovali, purifikovali a množili jsou na cestě do laboratoře v Německu, kde nám je vědci osekvenují (na takový přístroj je přeci jen naše laboratoř značně malá). Než jsme vzorky odeslali, tak jsme každý vzorek DNA rozdělili do 4 eppinek a do každé z nich přidlai jeden ze čtyř různých primerů (úseků DNA, které jsou schopny nasednout na část našeho genu a jsou pro sekvenci zásadní). Dva primery jsou vytvořeny pro každé ze dvou vláken DNA, jeden na začátek genu a jeden do jeho středu (druhý pak analogicky, akorát u opačného vlákna), čímž si zajistíme, že osekvenujeme celý gen co nejpřesněji.
Sekvenace pak v laboratoři probíhá zjednodušeně takto: DNA se nechá replikovat (tj. tvořit ke každému vláknu na základě komplementarity bází lákno druhé), přičemž replikace vždy začíná na námi přidaných primerech. To by samo o sobě nebylo ničím zvláštní, stejný proces probíhá v buňkách našeho těla denně. V našem případě se ale nikdy nebude replikovat celé vlákno – zcela náhodně se místo normálního nukleotidu (základní stavební jednotky DNA) naváže terminační nukleotid, který ještě navíc pro každou ze čtyř bází nese fluorescenční barvivo. Vlákno se tedy replikovat přestane a navíc je barvivem označena jeho poslední báze. Tyto úseky RNA pak necháváme projít kolonou, s tím že nejkratší úseky projdou nejrychleji (jsou menší a mezi částečkami kolony se tolik nezbrzdí), zatímco ty nejdelší budou procházet kolonou nejpomaleji. Na spodní části kolony je pak fluorescenční detektor, který snímá fluorescenční barvivo, které zrovna kolonou prošla. To pak lze vykreslit do grafů, na kterých tedy můžeme vidět, kterými bázemi končí úseky, které máme díky tomuto způsobu seřazeny od nejkratšího po nejdelší. Proto se také používají 4 různé primery – je menší pravděpodobnost, že se replikace dostane až k delším úsekům, nemohli bychom si tedy být jisti, zda bychom nasbírali dostatek dat. Použitím 4 primerů se tomuto problému ale vyhýbáme.
Teď už nezbývá než čekat na výsledky z laboratoře a modlit se, že je budeme moci použít a odeslat do genové databáze. Jinými slovy, že je odborný tým v USA zkontroluje a propustí celému vědeckému světu k nahlédnutí. A taky trochu doufáme, že se naše jména i jméno naší školy objeví v této prestižní společnosti.
                                                       
                                                                                                    Markéta Bařinková MB

Zvítězili jsme!!!                                                                            

14.4.2016
Nadešel moment pravdy – ať předchozí zkoušky vyšly, či nevyšly, vše ve výsledku závisí jen na sekvenacích, které nám přišly graficky z laboratoře v Německu. Ty budeme během příštích dvou kroužků zpracovávat na hodinách bioinformatiky.  Každé skupině náleží osm různých souborů – 4 pro každou rostlinu, tedy Potos a Arabidopsis. Každý soubor obsahuje sekvenaci odeslaného genu se všemi šumy a nepřestnostmi.  Soubory otevíráme v počítačovém programu i Finch a pouštíme se do práce. Naším prvním úkolem je vyřadit vzorky, které nejsou k dalšímu zpracování vhodné. To můžeme například podle grafu kvality (obr. 1), na kterém vidíme, jak kvalitní (použitelné k dalšímu zpracování) jsou určité části sekvence. Pokud jde modrá čára určující kvalitu nad čerchovanou hranici, je tato část vzorku s největší pravděpodobností správně přečtena (v našem vzorku by tedy s dostatečně velkou pravděpodobností odpovídalo realitě měření od přibližně 50. do 900. báze.


Obr. 1 - skupina 4, Potos

I po vyřazení nevhodných sekvencí zůstává každé skupině dostatek dat alespoň z jedné rostliny, což je samo o sobě menším úspěchem… ale s tím se po měsících práce pochopitelně nesmíříme.
    Dále tedy pracujeme jen s nejvhodnějšími soubory. Data ze stejné rostliny vkládáme do dalšího programu, tentokrát do BLASTu.  BLAST má pro práci s geny a tedy i pro nás velkou hodnotu  - složí totiž sekvence ze všech souborů do jedné, té nejpravděpodobnější (ta je momentálně znovu tou směsicí písmen A,G,C,T.  A znovu a znovu  bioinformatická kontrola, úprava, použití dalších a dalších aplikací  Všechna nejasná místa v sekvencích  upravujeme , srovnáváme ,až nakonec  máme zato, že naše sekvence genu bude  akceptovatelná vědeckým světem .   


Takto upravenou sekvenci znovu házíme do BLASTu, tentokrát už ji však srovnáváme se sekvencemi jiných rostlin. Gen sám o sobě se totiž nachází ve všech rostlinách). Zde přichází první velké překvapení – kromě podobnosti Potosu s rostlinou Arabidopsis se objevuje mimo jiné i Čínský lotus nebo Staphylococcus. Proč? Snažíme se hledat odpověd, diskutujeme , konzultujeme.. 
    Pro další část postupu je ještě nutné vyčlenit  introny a exony. , Zjednodušeně :  DNA se liší od mRNA právě v přítomnosti  i nekodujících oblastí. Někteří z nás narážejí na  zádrhel  –  DNA  segment genetické informace velmi málo intronů. Další záhada. Ale v týmu nás je devět a tudíž pracujeme s nejshodnějšími výsledky.
 Nakonec se nám podařila dát dohromady sekvence části genu GAPDH u Arabidopsis  Thaliana(Potos vyšel jen v jedné skupině a tak jsme nemohli mít jistotu, že jde skutečně o požadovanou sekvenci. Pořadí  nukleotidů je za pomocí další aplikace  konečně nahráno do centra ověřování.



Pak už nezbývalo nic než čekat a modlit se, jestli bude naše sekvenace přijata nebo ne…
 Posledním odkliknutím končí naše dlouhá výzkumná cesta.  A čekáme týden, dva …, až konečně přichází e-mail . Ano, sekvence přijata, jsme v rodině vědců, kteří přispívají do genové databáze.    
   
Nakonec všechno dobře dopadlo – naše sekvenace byla bankou přijata (pokud by vás to zajímalo, můžete se na sekvenaci podívat na http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KX086568.1. Kryštof nám dokonce pomohl objasnit i záhadu nedostatku intronů – to, co jedna  skupina sekvenovala, nebyl totiž pravý gen, ale takzvaný pseudogen (https://en.wikipedia.org/wiki/Pseudogene), tedy nekódující gen vzniklý mutací. Přestože ne vše vždy dopadlo dle našich představ, tak  jsme načerpali mnoho nových znalostí a dovedností, vyzkoušeli si na vlastní kůži, jak může vypadat skutečný vědecký výzkum a dokonce přispěli nasbíranými daty do celosvětové databáze, což ostatně není věc, kterou by se mohl chlubit každý středoškolák. Od prvního krůčku, kdy jsme ani netušili, jak náročné to bude, uplynulo  celých sedm měsíců!  Ale zvítězili jsme! 

                                                                                               Markéta  Bařinková  MB     

Korekturu a mírnou úpravu textu provedla  : Irena Skolilová